一、測序原理

 

　　ABI_3500測序儀采用的是熒光標(biāo)記的鏈終止法（Sanger測序法）。該方法的基本原理是利用四種不同的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸（dNTPs）合成DNA鏈。在DNA合成過程中，隨機(jī)摻入一種熒光標(biāo)記的鏈終止核苷酸，導(dǎo)致合成的DNA鏈在特定位置終止。通過電泳分離不同長度的DNA片段，并利用激光激發(fā)熒光信號，測序儀能夠讀取每個片段的序列信息。

 

　　二、操作步驟

 

　　1.樣品準(zhǔn)備

 

　　在進(jìn)行測序之前，首先需要提取和純化DNA樣品。確保樣品的濃度和純度符合測序要求。通常，使用納米滴定儀（NanoDrop）測定DNA濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的完整性。

 

　　2.反應(yīng)體系配置

 

　　根據(jù)ABI3500的操作手冊，配置PCR反應(yīng)體系。一般包括DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶和緩沖液。確保所有試劑均為新鮮且未過期。

 

　　3.PCR擴(kuò)增

 

　　將配置好的反應(yīng)體系放入PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)定合適的循環(huán)條件，包括變性、退火和延伸溫度及時間。擴(kuò)增完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的大小和純度。

 

　　4.測序反應(yīng)

 

　　將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的鏈終止核苷酸和DNA聚合酶混合，進(jìn)行測序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶切或純化方法去除未反應(yīng)的核苷酸。

 

　　5.電泳分離

 

　　將純化后的樣品加載到ABI3500的毛細(xì)管中，進(jìn)行電泳分離。儀器會根據(jù)DNA片段的大小和熒光信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。

 

　　6.數(shù)據(jù)分析

 

　　電泳結(jié)束后，使用ABI3500附帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。軟件會自動識別熒光信號并生成測序結(jié)果。用戶可以根據(jù)需要導(dǎo)出序列數(shù)據(jù)，并進(jìn)行后續(xù)分析。

 

　　三、注意事項(xiàng)

 

　　1.樣品質(zhì)量

 

　　樣品的質(zhì)量直接影響測序結(jié)果。確保DNA樣品無污染，且濃度適中。

 

　　2.試劑選擇

 

　　使用高質(zhì)量的試劑和耗材，避免因試劑問題導(dǎo)致的測序失敗。

 

　　3.儀器維護(hù)

 

　　定期對ABI3500進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)，確保儀器的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

 

　　4.數(shù)據(jù)存儲

 

　　測序數(shù)據(jù)應(yīng)及時備份，避免因數(shù)據(jù)丟失影響后續(xù)研究。