在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段，耗材的選擇至關(guān)重要。推薦使用低吸附的PCR管或96孔板，并確保管蓋閉合。反應(yīng)體系的配制需要在冰上進(jìn)行，各組分要充分混勻。引物和探針的濃度需要優(yōu)化，通常引物終濃度為0.2-0.5μM，探針終濃度為0.1-0.2μM。模板DNA的加入量建議在1-100ng之間，過高可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降。

 

　　程序設(shè)置是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。退火溫度需要根據(jù)引物的Tm值確定，通常比Tm低3-5℃。延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段長度設(shè)置，一般按每分鐘延伸1kb計(jì)算。建議設(shè)置熔解曲線分析步驟，以驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。對于多重PCR，需要仔細(xì)優(yōu)化各通道的熒光采集溫度，避免信號干擾。

 

　　數(shù)據(jù)分析時(shí)，要正確設(shè)置基線范圍和閾值線。基線通常選擇3-15個(gè)循環(huán)，閾值線設(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期的線性范圍內(nèi)。對于相對定量，需要選擇合適的內(nèi)參基因，并使用ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。絕對定量則需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保擴(kuò)增效率在90%-110%之間。

 

　　儀器維護(hù)不容忽視。每月清潔樣品槽和光學(xué)系統(tǒng)，使用無水乙醇擦拭樣品槽，用鏡頭紙清潔光學(xué)元件。每季度校準(zhǔn)溫度控制系統(tǒng)，使用專用校準(zhǔn)試劑盒驗(yàn)證各孔溫度準(zhǔn)確性。每年進(jìn)行全面的光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)，確保熒光檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

 

　　掌握這些操作技巧，就能充分發(fā)揮Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀的性能，獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。隨著使用經(jīng)驗(yàn)的積累，實(shí)驗(yàn)人員還能根據(jù)具體研究需求，開發(fā)出更優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案。